TƏDQİQATIN MATERİAL VƏ METODLARI

Tədqiqatın material və metodları

Tədqiqat işləri Azərbaycan Elmi – Tədqiqat Baytarlıq İnstitutunda 1994 – 2009 – cu illərə qədər Brusellozu və Vərəmi öyrənən laboratoriyada, sonralar isə heyvanların infeksion xəstəliklər laboratoriyası və bakterioloji mətbəx, elmi istehsalat və tətbiq şöbəsində, son diaqnostik və profilaktik təlimatlara müvafiq olaraq icra edilmişdir. Hazırda brusellozun diaqnostikasında istifadə olunan seroloji üsullar serumda spesifik anticismlərin axtarılması prinsipinə əsaslanır. Aqqlütinasiya reaksiyası heyvanlarda kütləvi müayinə zamanı qoyun keçilərdə 1: 25, 1: 50, qaramalda 1: 50, 1: 100 nisbətlərdə qoyulyr. İlkin durultmada müayinə üçün 0,1 ml müayinə olunan serum götürülür, göstərilən titrlərdə fizioloji məhlulda durulaşdırılır və üzərinə 1: 10 fizioloji məhlulla duruldulmuş vahid bruselloz antigeni 0,5 həcmdə əlavə edilir. 1 – ml vahid bruselloz antigenində 10 milyard brusella cismciyi var. 1 – ml 1: 10 durultma hazırladıqda 1ml – də 1 – milyard mikrob cismciyi qalır, ondan 0,5 ml serumun üzərinə əlavə edildikdə hər mixbərə 500 milyon bruselloz cisimciyi düşür. Qaramalda 1: 100, qoyun, keçidə 1: 50 ən azı 2 ++ aqqlütinasiya müşahidə olunarsa, reaksiya müsbət, heyvan isə bruselloz hesab edilir. Əgər 0,1 ml müayinə olunan serumun 1: 50; 1: 100 durultmaları “in vitro” (mixbərdə) 500 milyon bruselloz cismciyini elektrolitik mühitdə 18 – 24 saatdan sonra çökərək lizis edirsə, 20 – litr qanı olan heyvanın ən azı 45% – ni serum təşkil edir ki, bu da təxminən 1 heyvan üçün təxminən 9 litrədək serum deməkdir. Bunun isə “in vivo” nə qədər brusellaları neytrallaşdırmaq qabiliyyətinə malik olduğunu riyazi hesablamaqla daha aydın görmək olar. Belə olan halda həmin orqanizmlər təhlükəli, infeksiya mənbəyi və ya xəstə sayıla bilərmi? Bəlli ki, yox! Çünki, ziddiyyətli mənbələr və alınmış nəticələr göstərilənləri bir daha təsdiq edir.

Bundan başqa 45 baş ada dovşanları vahid bruselloz antigeni ilə 1 – ci gün 1ml, 6 – cı gün 2 ml, 14 – cü gün 2,5 ml bud nahiyyəsindən əzələ daxilinə immunizasiya edilmiş, 21- ci gün serumun titri AR – lə yoxlanılmış, ən aşağı titr 1: 160, yuxarı isə 1: 1280 titrlər olmuşdur. Sonra hər iki titrlərin mixbərlərinin çöküntüsü 1: 5 – dən 1: 1280 – ə qədər müxtəlif ada dovşanlarına immunizasiya edilmiş, 5 – gündən sonra nəticələri aşagıdakı kimi olmuşdur: Son hədd titri AR – lə 1: 160 olan serumun 1: 5, 1: 10, 1: 20 – ə qədər duruldulmuş 18 – 24 saat sonrakı çöküntüsündən ada dovşanlarına immunizasiya etdikdə spesifik anticismlər əmələ gəlməmiş, sonrakı titrlərin çöküntüsünə qarşı əmələ gəlmişdir. Son hədd titri AR lə 1: 1280 olan serumun 1: 5, 1: 10, 1: 20, 1: 40, 1: 80 durultmalarına qarşı spesifik anticismlər əmələ gəlməmiş, lakin 1: 160 – dan yuxarı çöküntülərə qarşı spesifik anticismlər əmələ gəlmişdir. Təcrübələr 3 – dəfə təkrar edilmiş, eyni nəticələr alınmışdır. 2009 cu ilin hesabatında bu barədə məlumat verilmiş, Az. ETBİ – nin elmi şurası hesabatı qəbul etmişdir. Növbəti təcrübədə 10 – ada dovşanına 1973 – cü ilin istehsalı olan 19 ştamla hərəsinə 1ml hesabilə qarınaltı nahiyədən subdermal, intraperitonal immunizasiya edilmişdir. Eyni zamanda 1989 – cu ilin istehsalı olan vahid bruselloz antigeni ilə 10 ada dovşanlarına eyni qayda ilə 1ml həcmdə immunizasiya edilmişdir. Nəzarətdə isə yararlılıq müddəti keçməyən Rev – 1, şt – 82 və vahid bruselloz antigeni götürülmüşdür. 7 – gün fasilə ilə 3 dəfə təkrar artan doza ilə immunizasiya edilmişdir. Hər immunizasiyadan sonra ada dovşanlarının qulaq venasından 1,5 -2 ml qan alınaraq serumu ayrılmışdır. Nəticələr ÇBS – ilə müsbət olmuşdur. Paralel ada dovşanları qansızlaşdırılaraq daxili orqanlarından 1: 10 suspenziya (1q kütlə, 10 ml 0,85% – li fizioloji məhlul) hazırlanmış, hər nümunədən 2 – baş ada dovşanının bud əzələsinə 1ml inyeksiya edilmiş, 5 – gündən sonra qulaq venasından qan alınaraq serumu ayrılmış. Reaksiyanın ÇBS – la nəticələri bütün heyvanlarda mənfi olmuşdur. Digər təcrübədə 59 – baş cins qaramaldan 10 qramlıq birdəfəlik steril şprislə qan nümunəsi sterillik gözlənilməklə götürülmüş, yerindəcə 1 ml hesabı ilə yeni AF2 və mövcud Ət peptonlu, qaraciyərli, qlükozalı, qliserinli, (ƏPQQQ) bulyon və aqar qida mühitlərinə əkilmişdir. Qalan qan nümunələri seroloji müayinə üçün götürülərək laboratoriyada kompleks mövcud və yeni müayinə üsulları ilə müqayisəvi yoxlanılmış, nəticədə 8 baş ÇBS, AR – lə müsbət, 2 baş ÇBS – ilə 2 müsbət olmuşdur. Bakterioloji müayinənin nəticələri bütün nümunələrdə mənfi olmuşdur. Həmçinin, müsbət olan 8 serumların AR – lə 20 saatdan sonrakı 1: 50, 1: 100 çöküntülərini 40 – baş ada dovşanına bioloji sınaq qoyulmuş, 5 gündən sonra diaqnostik titrdəki çöküntülərin nəticələri mənfi olmuş, yuxarı titrlərdə müsbət olmuşdur. ÇBS ilə 2 müsbət olanlar AR – lə 1: 40 titrdə olmuşdur. 20 saatdan sonrakı çöküntülərin 1: 50, 1: 100 titrlərdə hərəsi 2 baş ada dovşanının bud əzələsinə 1 ml hesabı ilə inyeksiya edildi. Nəticə isə ÇBS ilə müsbət oldu. Nəzarətdə hiperimmun bruselloz serumunun standart vahid bruselloz antigeninin 18 saatdan sonrakı 1: 50, 1: 100 çöküntüləri hərəsi 2 baş ada dovşanına immunizasiya eyni qayda ilə bud əzələsinə inyeksiya edilmiş, nəticələri 5 – ci gün diaqnostik titrlərdə spesifik anticismlərin təsirindən standart antigen in vitro (mixbərdə) lizis olduğundan spesifik anticismlər əmələ gəlməmişdir. Müsbət serumların vahid bruselloz antigeni ilə Həlqə Presipitasiya Reaksiyası ilə nəticələri eyni olmamış, ləngimə müşahidə edilmiş, (çarpaz aqqlütinasiya) nəzarətdə isə reaksiya 16 – cı dəqiqədə müsbət olmuşdur. 3 – cü təcrübədə vahid bruselloz antigeni 6 mixbərdə hərəsində 4 – ml olmaq şərtilə götürülmüş 30, 60, 90, 120, 150, 180 dəqiqə intervallarda suda qaynadılmış, hər nümunədən 2 – ədəd ada dovşanlara enteral, subdermal, intraperitonal və əzələyə inyeksiya edilmişdir. 5 gündən sonra nəticələr CBS – ilə yoxlanılmış nəticə müsbət olmuşdur. Antigen qaynama temperaturunda 3 – saat saxlanıldıqdan sonra da spesifik anticism əmələ gətirmə qabiliyyətini saxlamışdır. Spesifik anticismlərin əmələ gəlməsi 5 gün ərzində olduğu halda, enteral immunizasiyada 7-10 cu gün spesifik anticismlərin əmələ gəlməsi Az. ETBİ –də 2008 – ci il tarixdə komissyon təsdiq edilmişdir. Növbəti təcrübədə vahid bruselloz antigeni 7 ada dovşanına və ya 3 – baş qoçun bud əzələsinə 1,5 ml, 7 gün fasilə ilə artan dozada 7 – ci gün 2 ml, 14 – cü gün 2,5 ml, inyeksiya edilmiş, hər 10 gündən bir qanın serumu seroloji müayinəyə cəlb еdilmişdir. Hər seroloji müayinə zamanı ada dovşanlardan 1 – i qansızlaşdırılmış, serumu ayrılmış, daxili orqanlarından və sümük iliyindən steril şəraitdə mövcud və yeni bulyon qida mühitlərinə əkmələr edilmiş, 1 sutkadan başlayaraq 3 cü sutkaya qədər nəzarət edilmiş, qida mühitinin ph –ı yoxlanılmış neytral olmuşdur. Nəzarətdə isə Yordaniya və Qırğızıstan istehsalı olan Rev – 1 bruselloz vaksini əkilmişdir. 1 – 3 sutkadan sonra bulyonda ph 8 – 10 olmuş, aqara əkilmiş, 2 günlük aqar 0,5% – li fenolun fizioloji məhlulu ilə aqar yuyulmuş, hazırlanmış suspenziya 70 dərəcə C də 1 – saat su hamamında inaktivasiya edilmiş, sonra 16 saat soyuducuda saxlandıqdan sonra monospesifik hiperimmun bruselloz serumu ilə Həlqə Presipitasiya (HPR) ilə yoxlanılmışdır. Nəzarətdə isə Rev – 1 dən hazırlanmış antigen, vahid bruselloz antigeni pozitiv, neqativ və müayinə olunan heyvanın serumu götürülmüş, nəticələr müqayisə edilərək, diaqnostik qiymətləndirilmişdir. Həlqə Presipitasiya reaksiyası (HPR) sınaq təcrübəsində 0,3 ml 1: 10 hazırlanmış suspenziya, 0,3 üzərinə standart pozitiv serum, nəzarətdə isə eyni qayda ilə standart vahid bruselloz antigeni pozitiv, neqativ və müayinə olunan serumla 55 dərəcə su hamamında 4 dəqiqə saxlanıldı, sonra 4 dəqiqə soyuq suya mixbərlər keçirildi. Proses 4 dəqiqə fasilə ilə isti soyuq rejimdə saxlanıldı. Reaksiyanın nəticəsi nəzarətdə standart vahid bruselloz antigeni ilə pozitiv serumla reaksiya gedəndə dayandırıldı və nəticələr müqayisə edilərək diaqnostik qiymətləndirildi. Antigen üzərində alınan nəticələrə görə ada dovşanlarının qanında 4 – 5 – ci gündən başlayaraq spesifik anticismlər əmələ gəlir. Rev – 1 antigenin, vahid bruselloz antigenindən fərqli cəhəti HPR ilə nəticə 16 – 30 dəqiqədə deyil, 1 -3 saat ərzində reaksiyanın ləngimişdir. Orqanlardan hazırlanmış suspenziya diri çəkisi 2 kq olan ada dovşanına və ya 1 aylıq broyler cücəsinə hər nümunə 2 – başa bud və ya döş əzələsinə 1 ml hesabı ilə inyeksiya edildi. Bioloji sınaqla 5 – ci gün serumun ÇBS və HPR – ilə nəticəsi mənfi olmuş, nəzarətdə isə Rev – 1 antigen və vahid bruselloz antigeni olduğundan nəticə hər iki reaksiya ilə müsbət olmuşdur. Lakin Rev – 1 antigenə qarşı spesifik anticismlər 11 – 14 gündən sonra müsbət olmuşdur. Orqanlardan hazırlanmış suspenziyalardan yalnız qaraciyər suspenziyası HPR – ilə müsbət olmuş, lakin bioloji sınağın nəticəsi mənfi olmuşdur. Bu təcrübələr eyni qayda ilə Ştamm – 82, Rev – 1, Ştamm – 19 la paralel aparılmış, 7 – 14 gündən başlayaraq ÇBS, AR, KBR və HPR ilə müayinə edilmiş serumun nəticələri müsbət olmuş, Lakin HPR ilə reaksiya 1 – saata qədər ləngimişdir. Orqanlardan hazırlanmış suspenziyaların nəticələri standart vahid bruselloz antigeninin nəticələri ilə eyni olmuşdur. Ədəbiyyat məlumatlarının və aparılan təcrübələrin təhlili bizim aşağıdakı nəticələrə gəlməyimizə əsas verir.